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WB-考馬斯亮藍(lán)染色法

 更新時(shí)間:2024-09-21 點(diǎn)擊量:469

一、考馬斯亮藍(lán)結(jié)構(gòu)

考馬斯亮藍(lán)R-250G-250染料是二磺酸化三苯基甲烷化合物的兩種化學(xué)形式,結(jié)構(gòu)上R-250G-250少了2個(gè)甲基。

 

二、蛋白質(zhì)染料要求

用染料和生物大分子結(jié)合形成有色的復(fù)合物是電泳后檢測常用的方法。選用染料通常應(yīng)考慮以下要求:
1. 必須與大分子結(jié)合以形成一個(gè)不溶性的,有色的,緊密的復(fù)合物,但不結(jié)合到凝膠中和支持膜上,以便從凝膠中除去,否則高背景會(huì)影響蛋白帶的辨別和定量掃描。
2. 染料必須容易溶解在對(duì)大分子沒有影響的溶劑中,以利于背景的脫色。
3. 選用高吸光系數(shù)的染料有利于提高定量測定的靈敏度。
4. 選用能與大分子有專一性結(jié)合的染料,并在結(jié)合后能產(chǎn)生不同的顏色(如熒光),可以提高檢測的選擇性和靈敏度。

 

 

三、考馬斯亮藍(lán)染色的應(yīng)用

考馬斯亮藍(lán)又稱為Bradford法,是一種常用的蛋白定性定量分析方法。其主要利用Coomassie Brilliant Blue G-250這種酸性染料與蛋白質(zhì)在酸性環(huán)境下產(chǎn)生吸附,導(dǎo)致染料的最大吸光波長從465 nm變?yōu)?/font>595 nm。通過制備不同濃度的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品液,Bradford試劑混合后測定其595 nm吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。與標(biāo)準(zhǔn)品同量的樣品蛋白溶液與Bradford試劑混合。5 min后在595 nm波長下測定各樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出各樣品的蛋白濃度。

此外,考馬斯亮藍(lán)(Coomassie Brilliant Blue)與麗春紅染色一樣,也是WB實(shí)驗(yàn)中常用的染色方法。

 

四、考馬斯亮藍(lán)染色的步驟

1)電泳結(jié)束后,將膠板取出放入加有超純水的平皿中潤洗,以去除殘留電泳液。

2)之后加入考馬斯亮藍(lán)染液浸沒,放至水平搖床室溫30 min或更長時(shí)間進(jìn)行染色(具體根據(jù)凝膠厚度和溫度進(jìn)行調(diào)整),直至凝膠與染色液顏色十分接近。

3)棄去染色液或回收染色液(可回收使用3次左右)。

4)脫色直至背景清晰。

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